Original article

Preparation and radical scavenging activity of papain-catalyzed casein plasteins

酪蛋白类蛋白物的木瓜蛋白酶法制备及其自由基清除活性

Préparation de plastéines à partir de la catalyse de caséines par la papaïne et leur activité anti-radicalaire

Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, P.R. China

^* Corresponding author (通讯作者): zhaoxh@mail.neau.edu.cn

Received: 27 May 2009
Revised: 3 November 2009
Accepted: 12 November 2009

Abstract

The aim of this study was to prepare papain-catalyzed casein plasteins and to demonstrate the influence of the plastein reaction on the radical scavenging activity. Casein was initially hydrolyzed with papain under selected conditions to give a degree of hydrolysis of 9.6%. The casein hydrolysates were then subjected to papain-catalyzed plastein reaction to prepare casein plasteins. The formation of plasteins in the prepared casein plasteins was confirmed by size exclusion chromatography. The optimal conditions for the plastein reaction, determined by response surface methodology using the decrease of free amino groups in the casein plasteins as the response variable, were as follows: papain addition level was fixed at 500 U·g⁻¹ proteins, reaction temperature 30 °C, concentration of casein hydrolysates 50% and reaction time 5.6 h. Six different casein plasteins were prepared and the radical scavenging activity on two radicals, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2′-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), was evaluated by the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC). Analysis showed that all casein plasteins had improved radical scavenging activities. Compared to casein hydrolysates, the scavenging activity of the casein plasteins on DPPH radical had a seven- or ninefold increase, as TEAC increased from 10.45 to 73.41 or 90.31 mmol·g⁻¹ proteins, while a onefold increase was detected on ABTS⁺ (TEAC increased from 8.33 μmol·g⁻¹ to 15.09 or 16.45 μmol·g⁻¹ proteins). The results of this study clearly showed that the papain-catalyzed plastein reaction could be applied to prepare casein antioxidant peptides with higher activity, and that the plastein reaction may have a new application in dairy science.

摘要

本研究利用木瓜蛋白酶催化制备酪蛋白类蛋白物，证明类蛋白反应影响酪蛋白类蛋白物的自由基清除活性。首先，在选定的条件下用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，制备出水解度为 9.6% 的酪蛋白水解物；然后，酪蛋白水解物进行类蛋白反应制备酪蛋白类蛋白物，并且用排阻色谱证实所制备的酪蛋白类蛋白物中有类蛋白形成。优化的类蛋白反应条件，通过以酪蛋白类蛋白物的游离氨基含量降低为指标、利用响应面法而确定，它们分别是: 木瓜蛋白酶添加量固定为每克蛋白质 500 U，反应温度为 30 °C，酪蛋白水解物质量分数为 50%，反应时间为 5.6 h。制备 6 个反应程度不同的酪蛋白类蛋白物，并评价它们对 2 个自由基 1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2’-连氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS) 的 Trolox等价抗氧化能力 (TEAC)。 分析结果显示，所有的酪蛋白类蛋白物的自由基清除活性得到改善。 与酪蛋白水解物相比，酪蛋白类蛋白物对 DPPH 自由基的清除活性增加 6 ~ 7 倍，因为它们的TEAC从10.45 mmol·g⁻¹ 增加至 73.41 或 90.31 mmol·g⁻¹，而对 ABTS 自由基的清除活性则增加1倍 (TEAC 从 8.33 μmol·g⁻¹ 增加至 15.09 或 16.45 μmol·g⁻¹)。

Résumé

L’objectif de cette étude était de préparer des plastéines à partir de la catalyse de caséines par la papaïne et de démontrer l’influence de la réaction de formation des plastéines sur l’activité anti-radicalaire. La caséine a été préalablement hydrolysée par la papaïne dans des conditions sélectionnées afin d’obtenir un degré d’hydrolyse de 9,6 %. Les hydrolysats de caséine ont ensuite été soumis à une réaction de catalyse par la papaïne pour préparer les plastéines. La formation des plastéines a été confirmée par chromatographie d’exclusion de taille. Les conditions optimales de la réaction, déterminées par la méthode de surface de réponse avec comme variable la diminution des groupements amine libres dans les plastéines, étaient les suivantes : niveau d’addition de papaïne fixé à 500 U·g⁻¹ de protéines, température de réaction 30 °C, concentration en hydrolysats de caséine 50 % et temps de réaction 5,6 h. Six plastéines ont été préparées avec des étendues de réaction différentes et leurs activités anti-radicalaires sur le 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DDPH) et l’acide azino -2,2′ bis(ethyl-3-benzothiazoline sulfonique-6) (ABTS⁺) mesurées par la capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC). Les résultats ont montré que toutes les plastéines obtenues avaient des activités anti-radicalaires améliorées. Comparée à celle des hydrolysats de caséine, l’activité anti-radicalaire des plastéines était sept à neuf fois plus importante pour le DDPH (TEAC passant de 10,45 mmol·g⁻¹ à 73,41 ou 90,31 mmol·g⁻¹ protéines) tandis qu’elle avait doublé pour ABTS⁺ (TEAC passant de 8,33 μmol·g⁻¹ à 15,09 ou 16,45 μmol·g⁻¹ protéines). Ces résultats indiquent clairement que la réaction de formation des plastéines catalysée par la papaïne pourrait être appliquée pour préparer des peptides antioxydants avec des activités améliorées à partir de caséines, et que cette réaction pourrait trouver une nouvelle application en science laitière.