Original article

A rapid HPLC method for the extraction and quantification of vitamin B₁₂ in dairy products and cultures of Propionibacterium freudenreichii

HPLC 法快速提取和定量测定乳制品和费氏丙酸杆菌发酵产品中维生素 B₁₂

Une méthode HPLC rapide pour extraire et quantifier la vitamine B₁₂ dans les produits laitiers et les cultures de Propionibacterium freudenreichii

¹ Department of Food Technology, Cape Peninsula University of Technology, Bellville 7535, South Africa
² Department of Food Science, University of Stellenbosch, Stellenbosch 7600, South Africa

^* Corresponding author (通讯作者): vanwykj@cput.ac.za

Received: 7 March 2009
Revised: 11 November 2009
Accepted: 12 November 2009

Abstract

To overcome nutritional vitamin B₁₂ deficiencies in certain populations in Southern Africa, fortified functional foods have been developed. However, current microbiological methods used to accurately determine vitamin B₁₂ levels in foodstuffs, important for quality control and regulatory purposes, are time consuming. This study describes an extraction and detection method for vitamin B₁₂ in dairy products and growth media cultured with Propionibacterium freudenreichii. Samples were extracted by mixing in KCN buffer (pH 4.5), autoclaving at 121 °C for 25 min, cooling and centrifugation. The resultant supernatant was syringe-filtered prior to reversed-phase HPLC analysis using a methanol-water gradient that was effective in resolving the B₁₂ peak. The method offered excellent linearity with a regression coefficient R > 0.998. The limit of quantification was 0.005 μg·mL⁻¹ sample. For samples with vitamin B₁₂ concentrations well within the linear range of the assay, good repeatability was demonstrated for the same sample with mean concentrations of 2.62 ± 0.02 and 2.61 ± 0.02 μg·mL⁻¹ detected on day 1 and day 2, respectively. Recovery values ranged from 98.6% to 103.2%, indicating that the extraction method ensured complete dissolution of vitamin B₁₂ from the matrices under study. Sensitivity was enhanced by sample concentration and purification using a series of solid phase extraction steps which resulted in improved peak resolution and removal of interfering peaks. The method was validated by comparison of the HPLC results of the same sample with those obtained using traditional microbiological methods. The method is a rapid alternative to the more time-consuming microbiological assay.

摘要

为了治疗南非部分人群中出现的维生素 B₁₂ 缺乏症，在一些功能性食品中强化了维生素 B₁₂。然而目前用于食品中维生素 B₁₂ 检测的方法是微生物发酵法，该法特点是耗时。本文研究了乳制品和费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii) 发酵产品中维生素 B₁₂ 的提取和测定方法。乳样品与 KCN (pH 4.5) 缓冲溶液混合，在 121 °C 下高压灭菌 25 min，冷却、离心。上清液用于 RP-HPLC 分析，甲醇-水为流动相，进行梯度洗脱。 方法的线性回归系数为R > 0.998。定量检测限位为 0.005 μg·mL⁻¹。样品中维生素 B₁₂ 的浓度在测定方法的线性范围之内，方法的重现性较好，同一样品在第一天和第二天的测定值分别为 2.62 ± 0.02 μg·mL⁻¹和 2.61 ± 0.02 μg·mL⁻¹。方法的回收率在 98.6%~103.2%，表明所采用的提取方法能够完全溶解所研究基质中的维生素 B₁₂。采用一系列固相萃取技术将样品浓缩和纯化后，消除了干扰峰，维生素 B₁₂ 的色谱峰形好，使分析方法的灵敏度大大提高。将本研究方法的实验结果与传统微生物法测定的结果进行了对比，证明该法是快速、准确、可行的维生素 B₁₂ 分析方法。

Résumé

Pour lutter contre les carences en vitamine B₁₂ parmi certaines populations d’Afrique du Sud, des aliments fonctionnels enrichis ont été développés. Cependant, les méthodes actuelles utilisées pour analyser précisément le niveau de vitamine B₁₂ dans les aliments, qui sont importantes à des fins de contrôle-qualité et de législation, sont coûteuses en temps. Cet article décrit une méthode d’extraction et de détection de la vitamine B₁₂ dans les produits laitiers et les cultures de Propionibacterium freudenreichii. Les échantillons étaient extraits par mélange à du tampon KCN, pH 4,5 et autoclavage à 121 °C pendant 25 min, refroidissement et centrifugation. Le surnageant résultant était filtré puis analysé par HPLC en phase inverse en utilisant un gradient méthanol-eau, qui permettait une bonne résolution du pic de vitamine B₁₂. La méthode montrait une bonne linéarité, avec un coefficient de régression R > 0,998. La limite de quantification était de 0,005 μg·mL⁻¹ d’échantillon. Pour des échantillons contenant des concentrations dans la moyenne de la gamme de linéarité, la répétabilité a été établie, avec des valeurs obtenues pour le même échantillon à deux jours différents de 2,62 ± 0,02 μg·mL⁻¹ et 2,61 ± 0,02 μg·mL⁻¹. Les rendements d’extraction variaient entre 98,6–103,2 %, ce qui indique que la méthode d’extraction permettait une dissolution complète de la vitamine B₁₂ des matrices étudiées. La méthode HPLC était validée en comparant les résultats obtenus avec ceux de la méthode microbiologique de référence. La sensibilité de la méthode était améliorée par une série d’étapes d’extraction en phase solide pour concentrer et purifier les échantillons, ce qui améliorait la résolution des pics et éliminait les pics contaminants. La méthode décrite est une alternative rapide à la méthode microbiologique de référence.