Dairy Sci. Technol. 89 (2009) 519-529
DOI: 10.1051/dst/2009027

A chromatographic procedure for semi-quantitative evaluation of caseinphosphopeptides in cheese

Coralie Dupas¹, Isabelle Adt¹, Amandine Cottaz¹, Rachel Boutrou², Daniel Molle², Julien Jardin², Thierry Jouvet³ and Pascal Degraeve<sup>1

1</sup>  Université de Lyon, Université Lyon 1, Laboratoire de Recherche en Génie Industriel Alimentaire, EA 3733, Département de Génie Biologique IUT A, Technopole Alimentec, rue Henri de Boissieu, 01060 Bourg-en-Bresse cedex 9, France
²  INRA Agrocampus Ouest, UMR1253, Science et Technologie du Lait et de l'Œuf, 35042 Rennes, France
³  Actilait/ITFF Institut Technique du Lait et des Produits Laitiers, Technopole Alimentec, rue Henri de Boissieu, 01060 Bourg-en-Bresse cedex 9, France

Received 1st February 2009 - Revised 19 May 2009 - Accepted 9 June 2009 / Published online 4 August 2009

Abstract - Caseinphosphopeptides (CPPs) are phosphorylated fragments of caseins, which are found in dairy products. One of their unique features is their ability to bind calcium. There are several published methods to extract CPPs from cheese, but none allows their quantitative evaluation. A chromatographic procedure allowing a semi-quantitative evaluation of cheese CPPs was adapted from a previously published method and tested on Beaufort cheese. Water-soluble peptides were extracted from cheese and purified using cation-exchange chromatography followed by immobilised metal-ion affinity chromatography (IMAC). CPPs were identified using mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Fifty-five peptides, including 48 CPPs carrying one to three phosphorylations, were identified in Beaufort cheese. It can thus be considered that the selectivity of the chromatographic procedure proposed is sufficient for a semi-quantification of CPPs with a molecular mass ranging from 600 to 10 000 gmol^-1 in cheese. As IMAC fractions contain molecules with a molecular mass < 600 gmol^-1 (such as phosphoserine), a gel filtration step was performed in order to remove these compounds. The semi-quantification based on an estimation of the extinction molar coefficient of CPPs at 215 nm allowed to estimate that the CPPs content of the fresh Beaufort cheese sample analysed was around 1.9 g100 g^-1.

Résumé - Méthode d'évaluation semi-quantitative des caséinophosphopeptides dans le fromage.
Les caséinophosphopeptides (CPP) sont des fragments phosphorylés de caséine présents dans les produits laitiers qui possèdent la capacité de se lier au calcium. S'il existe différentes méthodes pour les extraire à partir de fromage, aucune ne permet cependant leur évaluation quantitative. La méthode proposée ici pour l'évaluation semi-quantitative des CPPs a été adaptée à partir de travaux publiés précédemment par une autre équipe ; elle a été appliquée au Beaufort. Après extraction des peptides hydrosolubles du fromage, les CPPs ont été purifiés par une chromatographie d'échange de cations suivie d'une chromatographie d'affinité pour les ions métalliques immobilisés (IMAC). Les CPPs ont ensuite été identifiés par spectrométrie de masse (LC-ESIMS/MS). Cinquante-cinq peptides, dont 48 CPPs portant de 1 à 3 phosphorylations, ont ainsi pu être identifiés dans le Beaufort. On peut donc considérer que la sélectivité de la procédure chromatographique proposée est suffisante pour une évaluation semi-quantitative des CPPs. Une étape de filtration sur gel a ensuite permis de séparer les molécules éluées après l'IMAC présentant une masse moléculaire inférieure à 600 gmol^-1, comme la phosphosérine. La teneur en CPPs, définis comme des composés phosphorylés présentant une masse moléculaire comprise entre 600 et 10 000 gmol^-1, de l'échantillon de Beaufort considéré, a ainsi pu être estimée à 1,9 g pour 100 g en se basant sur une estimation de leur coefficient d'extinction moléculaire à 215 nm.

Key words: caseinphosphopeptide / cheese / liquid chromatography / mass spectrometry

Mots clés : caséinophosphopeptide / fromage / chromatographie liquide / spectrométrie de masse

Corresponding author: pascal.degraeve@iut.univ-lyon1.fr

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