Dairy Sci. Technol. 89 (2009) 69-81
DOI: 10.1051/dst/2008034

A simple and rapid method for the disruption of Staphylococcus aureus, optimized for quantitative reverse transcriptase applications: Application for the examination of Camembert cheese

Wilfried Ablain^{1, 2, 3}, Sylvie Hallier Soulier³, David Causeur⁴, Michel Gautier^{1, 2} and Florence Baron<sup>1, 2

1</sup>  Agrocampus Ouest, Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex, France
²  INRA, UMR1253, Laboratoire de Science et Technologie du Lait et de l'Œuf, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex, France
³  Genesystems, 1 rue du Courtil, Centre CICEA, 35170 Bruz, France
⁴  Agrocampus Ouest, Laboratoire de Mathématiques Appliquées, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex, France

Received 17 April 2008 – Accepted 21 October 2008 - Published online 30 January 2009

Abstract - Transcriptomic studies of microorganisms are dependent upon the efficiency of the RNA extraction procedure. In this study, we compared different methods used to disrupt bacterial cells that are frequently described in the literature, such as mechanical (sonication, bead beating) and enzymatic (lysozyme or lysostaphin digestion) disruption. Factorial designs and ANOVA procedures were used to compare statistically the efficiency of these protocols on Staphylococcus aureus. The results were assessed in terms of quality and quantity of RNA extract suitable for further quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) analysis. We selected a simple, rapid (in less than four hours) and sensitive RNA extraction/purification protocol based on lysostaphin treatment, followed by a bead-beating procedure. This method allowed an excellent recovery (> 85%) of 16S rRNA from over a wide range of CFU (10⁹ to 10² CFUmL^-1), efficient on different S. aureus strains in both exponential and stationary growth phases in pure culture. Application of the protocol for the examination of artificially contaminated Camembert cheese achieved sensitivities of 1.1 10² copies of the 16S rRNA geneg^-1 of cheese. This protocol constitutes an essential tool for gene expression studies of S. aureus in Camembert cheese.

Résumé - Mise au point d'une méthode rapide et simple de lyse de Staphylococcus aureus, optimisée pour une analyse par RT-PCR en temps réel : Application à l'examen de camembert
Le succès de l'étude du transcriptome d'un microorganisme dépend de l'efficacité de l'extraction des ARN. Par cette étude, nous avons comparé différentes méthodes fréquemment rencontrées dans la littérature pour lyser les bactéries telles que les lyses mécaniques (sonication, bead beating) et enzymatiques (digestion au lysozyme ou à la lysostaphine). L'utilisation de plans d'expérience a permis de comparer statistiquement l'efficacité des différents protocoles sur Staphylococcus aureus. Les résultats sont comparés selon la qualité et la quantité des ARN extraits, par reverse transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR). Nous avons sélectionné un protocole d'extraction/purification des ARN, simple, rapide (en moins de quatre heures) et sensible, basé sur une digestion à la lysostaphine suivie d'un cassage par billes. Cette méthode permet une excellente récupération (> 85 %) de l'ARNr 16S à partir d'une large gamme d'UFC (10⁹ à 10² UFCmL^-1), et est efficace sur différentes souches de S. aureus en culture pure, en phase exponentielle ou stationnaire de croissance. L'application du protocole pour l'examen d'un camembert artificiellement contaminé permet de détecter jusqu'à 1.1 10² copies d'ARNr 16Sg^-1 de fromage. Ce protocole constitue un outil essentiel pour l'étude de l'expression des gènes de S. aureus en matrice camembert.

Key words: Staphylococcus aureus / cell lysis / RNA extraction / qRT-PCR / Camembert cheese

Mots clés : Staphylococcus aureus / lyse cellulaire / extraction d'ARN / RT-PCR quantitative / camembert

Corresponding author: florence.baron@agrocampus-ouest.fr

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